Monitoreo de todos los serovares de Salmonella en la producción avícola mediante la aplicación de un enfoque integrado de PCR y HTS

Jul 26, 2023

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La infección por Salmonella es una de las causas más comunes de enfermedades transmitidas por alimentos, lo que resulta en más de 80 millones de casos de salmonelosis transmitida por alimentos cada año en todo el mundo. La mayoría de las enfermedades se caracterizan por síntomas gastrointestinales como diarrea, fiebre y calambres abdominales, y las enfermedades más graves provocan discapacidad o la muerte.1 Si bien se ha encontrado contaminación por Salmonella en muchos tipos de alimentos, las aves y los productos avícolas, como la carne y los huevos, son bien conocidas por ser las principales fuentes de Salmonella no tifoidea. Las aves silvestres a menudo son portadoras de Salmonella, que puede transmitirse fácilmente entre las aves y mediante el movimiento del polvo y las pelusas en el aire en los gallineros. La salmonela se puede encontrar en aproximadamente el 18 % de las aves, el 22 % de los productos y más del 29 % de las muestras ambientales, según la prevalencia general agrupada de 157 estudios de 15 países.2 Los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) estiman que una de cada 25 paquetes de pollo que se venden en los supermercados está contaminado con Salmonella.

Salmonella comprende más de 2600 serovares, que difieren en su tasa de prevalencia, vía de transmisión y potencial patógeno. Ciertas serovariedades están frecuentemente asociadas con enfermedades humanas, mientras que muchas no lo están. Por ejemplo, se identificaron un total de 131 serotipos de 157 estudios realizados en 15 países, con Salmonella Heidelberg, Kentucky, Enteritidis y Typhimurium entre los más prevalentes en muestras de aves de corral y aquellos con la mayor prevalencia de resistencia antimicrobiana.2 Si bien estos serovares (particularmente Salmonella Enteritidis y Typhimurium) son fuentes de numerosos brotes, muchos otros serovares también se han asociado con brotes. La prevalencia de Salmonella serovar también varía según la ubicación y el tiempo. En el estudio reciente de los autores que involucró a 192 granjas avícolas en Ontario, Canadá, Salmonella Heidelberg, que anteriormente mostró una alta prevalencia, se redujo drásticamente.3 Como resultado, es importante monitorear todos los serovares para establecer un cuadro epidemiológico completo para implementar medidas efectivas para prevenir la transmisión de Salmonella de las granjas avícolas a las mesas de los consumidores.

Uno de los principales vehículos de infección por Salmonella son los huevos y los productos derivados del huevo contaminados con Salmonella Enteritidis. La bacteria puede penetrar los órganos reproductivos de las aves de corral, lo que da como resultado la contaminación del contenido del huevo.4 Como resultado, las agencias reguladoras en muchos países han establecido programas de monitoreo de higiene ambiental para detectar Salmonella Enteritidis para identificar parvadas potencialmente contaminadas para despoblar y prevenir huevos contaminados. de llegar al mercado.

Es importante notar, sin embargo, que otros serovares pueden estar involucrados en la contaminación de la cáscara del huevo. Por ejemplo, se informaron 52 enfermedades en seis estados en 2015 debido a huevos contaminados con Salmonella Oranienburg. Además, 45 consumidores de diez estados se infectaron con Salmonella Braenderup en 2018, lo que resultó en 11 hospitalizaciones y el retiro de 207 millones de huevos en todo EE. UU. Se han detectado otros serovares, como Salmonella Typhimurium e Indiana, en cáscaras de huevo recolectadas en 41 granjas en Australia .5 Muchos estudios también han sugerido que los insectos y los animales pueden actuar como vectores para la introducción de Salmonella en las aves de corral.6,7,8 Como resultado, en varias jurisdicciones es necesario lavar (desinfectar) los huevos antes de comercializarlos para mitigar la riesgo de contaminación de la cáscara de huevo. Además, la infección de ponedoras de huevos con ciertos serovares, como Salmonella Gallinarum y Pullorum, puede afectar la producción de huevos y causar una alta mortalidad entre las parvadas.9 Salmonella Typhimurium también puede causar lesiones que pueden conducir a la degeneración del oviducto y afectar negativamente la producción de alimentos.10

Los programas regulatorios y de vigilancia actuales generalmente se caracterizan por prácticas de muestreo variadas y se basan principalmente en resultados confirmados culturalmente para la aplicación regulatoria. Por ejemplo, en Canadá, la Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos (CFIA) tiene un programa nacional de control de Salmonella Enteritidis para la industria avícola; Tanto el seguro de CFIA como el de Salmonella Enteritidis cubiertos por la Alianza Recíproca de la Industria del Huevo Canadiense (CEIRA) requieren un resultado de cultivo confirmado para presentar un reclamo por una parvada despoblada debido a un resultado positivo de la prueba de Salmonella Enteritidis.

En los EE. UU., el Departamento de Agricultura (USDA) y la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) tienen el Plan Nacional de Mejoramiento Avícola (NPIP) con pautas y medidas específicas para controlar la propagación de Salmonella en las aves. Este plan es voluntario, aunque la mayoría de los productores optan por participar con fines comerciales. El NPIP también proporciona un programa cooperativo de la industria, estatal y federal a través del cual se pueden aplicar de manera efectiva nuevas tecnologías de diagnóstico para mejorar las aves y los productos avícolas en todo el país. El NPIP se inició en la década de 1930 para ayudar a disminuir la propagación desenfrenada de Salmonella Pullorum, que causó casi el 80 por ciento de mortalidad en las pollitas. Posteriormente, el programa se amplió para incluir el seguimiento de otras serovariedades, incluida Salmonella Enteritidis. El NPIP ha aprobado o aprobado temporalmente 12 métodos de detección rápida, de los cuales tres se enfocan en Salmonella Enteritidis, mientras que los métodos restantes se enfocan en la detección de Salmonella spp. y requieren aislamiento de cultivo para determinar un serotipo.

En octubre de 2022, el Servicio de Inspección y Seguridad Alimentaria (FSIS) del USDA publicó un marco regulatorio propuesto para reducir la contaminación por Salmonella en los productos avícolas. El FSIS está evaluando si los establecimientos deben considerar a la Salmonella como un peligro y tratar la Salmonella en la recepción como parte de sus planes de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP). Además, la propuesta requeriría que los establecimientos monitoreen los niveles de Salmonella o determinen los serovares en las parvadas entrantes. Según esta estrategia propuesta, los establecimientos tendrían que colaborar con sus proveedores y contratistas para garantizar que estén implementando las mejores prácticas para reducir la Salmonella en las instalaciones de reproducción, los criaderos, el engorde y durante todo el transporte. Sin embargo, las reglas, políticas, metodologías o protocolos específicos o adicionales para implementar la estrategia para lograr las metas de reducción aún no se han finalizado.

Los métodos estándar para la detección de Salmonella implican el enriquecimiento previo de una muestra en un medio no selectivo, como el agua de peptona tamponada (BPW). Los enriquecimientos previos se someten luego a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o al enriquecimiento secundario en medios selectivos, como el caldo Rappaport Vasiliadis Soy (RVS) y el caldo Tetrathionate Brilliant Green (TBG), seguido de una siembra en agar selectivo como el sulfito de bismuto. (BS), agar de sulfapiridina verde brillante (BGS) y agar de xilosa lisina desoxicolato (XLD). Las colonias sospechosas con características morfológicas de Salmonella se someten luego a confirmación mediante reacciones bioquímicas. Luego, una colonia confirmada de una muestra se serotipa en un laboratorio de referencia en función de las interacciones anticuerpo-antígeno siguiendo el esquema de Kauffmann-White,11 o se utiliza la secuenciación del genoma completo (WGS) para determinar su serovar.

Los métodos de cultivo implican múltiples pasos que tardan varios días en completarse y requieren técnicos calificados para realizarlos e interpretarlos. El enfoque actual favorece estadísticamente la detección de los serovares de Salmonella más abundantes en una muestra y pasa por alto los serovares de Salmonella menos abundantes, que aún pueden ser significativos para la salud pública. Esta discrepancia da como resultado un cuadro epidemiológico parcial y confuso y compromete la efectividad de las prácticas preventivas y de intervención. Teóricamente, probar más colonias de las placas de cultivo permitiría la detección de múltiples serovares; sin embargo, esto es prácticamente prohibitivo debido al aumento del costo y la mano de obra con la prueba de un mayor número de colonias.

Además, el enriquecimiento en diferentes medios selectivos, como RVS y caldo TBG, puede llevar a una detección sesgada de ciertos serovares de Salmonella.12,13 Este problema se vuelve más profundo cuando se requieren pruebas para identificar un serovariedad específico, como Salmonella Enteritidis. La investigación aún se limita a dilucidar por completo el impacto que tiene el sesgo de cultivo en la probabilidad de identificar con precisión todas las cepas de Salmonella en una muestra. flagelos) antígenos de superficie basados ​​en el esquema de Kauffmann-White,11 y se realiza principalmente en laboratorios de referencia debido a los exigentes requisitos de recursos y habilidades técnicas. Los métodos basados ​​en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se pueden usar para detectar un serotipo sin aislamiento de cultivo, pero solo pueden detectar un número limitado de serotipos predeterminados a la vez.16 El enfoque WGS aún implica el aislamiento de cultivo y se usa principalmente en laboratorios de salud pública para la subtipificación de patógenos.17,18,19

La aplicación de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS), basadas en la amplificación de regiones de identidad específicas, permite la elaboración de perfiles de muestras con poblaciones diversas. Los cebadores de PCR se utilizan para amplificar la región de interés de todos los organismos objetivo en una muestra, lo que elimina la necesidad de aislar cultivos puros con fines de identificación. Después de HTS, se utilizan herramientas sólidas de análisis de datos para clasificar secuencias y asignar identidades a grupos taxonómicos conocidos, lo que facilita la detección de organismos de interés en una muestra y también brinda información sobre la abundancia relativa. El uso de PCR y HTS puede eludir la necesidad de pasos adicionales de enriquecimiento y aislamiento requeridos por los métodos de cultivo estándar en la detección y serotipificación de Salmonella, ya que brindan la capacidad de perfilar todos los serovares de Salmonella presentes en una muestra mediante la secuenciación de una región de identidad contenida en todas las Salmonella. genomas

Los genomas de Salmonella contienen secuencias de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) que se pueden usar para diferenciar entre serovares. Un método recientemente informado llamado CRISPR-SeroSeq (serotipado por secuenciación) emplea HTS para perfilar los serovares de Salmonella en una muestra dirigiéndose a una región definida que contiene los loci CRISPR en el genoma de Salmonella.20 Las regiones de repetición directa se conservan y se usan como secuencias laterales para la PCR. amplificación. Las secuencias CRISPR de Salmonella disponibles públicamente se utilizan para construir una base de datos para asignar una identidad de serovariedad de Salmonella a secuencias de muestra desconocidas generadas en HTS de amplicones de PCR indexados. El número de secuencias asignadas a serovares de Salmonella particulares permite tanto la detección como el cálculo de la abundancia relativa de múltiples serovares de Salmonella en una muestra individual, incluidos los serovares predominantes y menos abundantes presentes en poblaciones mixtas. Se ha demostrado que el método CRISPR-SeroSeq tiene una sensibilidad de detección y una reproducibilidad similares a las de la PCR, tal como se validó con muestras ambientales de aves de corral. También es capaz de detectar simultáneamente serovariedades comunes de Salmonella, con serovariedades minoritarias detectadas en abundancias tan bajas como 0.01 por ciento en una población mixta de Salmonella.3

El uso de CRISPR-SeroSeq para perfilar las poblaciones de serotipos de Salmonella ofrece una imagen más completa y una mejor comprensión de los cambios observados en los serotipos de Salmonella detectados en varias etapas de la producción avícola, como se demostró en un estudio reciente realizado por Siceloff y colegas.21 El estudio reveló Salmonella la prevalencia del serovar en canales de pollos de engorde y partes de pollo crudo entre 2016 y 2020 en los EE. UU. e identificó diferencias regionales en los serovares de Salmonella, con las regiones del Atlántico y el Sudeste aislando Salmonella Typhimurium con mayor frecuencia en comparación con las regiones Sur-Central, Medio Oeste y Montaña y Oeste.

Los datos de vigilancia en diferentes etapas de producción también revelaron que, en todas las regiones, Salmonella Kentucky disminuyó en una proporción relativa dentro de las muestras, desde la canal hasta las partes de pollo crudas, mientras que Salmonella Enteritidis tuvo la tendencia opuesta. En Georgia, el aislamiento de Salmonella Kentucky aumentó entre 2016 y 2020 no solo en muestras de canales, sino que también fue el serotipo aislado con mayor frecuencia en muestras tomadas de parvadas reproductoras a las 15–19 y 40–45 semanas de edad. Otros serovares, como Salmonella Enteritidis, Typhimurium, variante I 1,4,[5],12:i:-, Infantis y Schwarzengrund, no se detectaron con tanta frecuencia en muestras de reproductores, pero se encontraron en muestras tomadas durante el procesamiento posterior. Los autores consideran que los procesos dirigidos a la reducción de Salmonella durante el procesamiento son efectivos para reducir Salmonella Kentucky, pero menos efectivos para reducir otros serovares presentes en las parvadas de reproductoras, que no fueron detectados debido a limitaciones en la selección de cultivo de solo el serovariedad dominante.

Siceloff y sus colegas21 también aplicaron CRISPR-SeroSeq para investigar la prevalencia de múltiples serotipos de Salmonella en muestras de aves de corral de Georgia entre 2020 y 2021 y descubrieron que Salmonella Kentucky era la más común de las 134 muestras analizadas, lo que coincidía con los resultados de la vigilancia. Sin embargo, el enfoque CRISPR-SeroSeq también identificó a Salmonella Cerro y Salmonella Mbandaka como los siguientes más comunes, así como los serovares Salmonella Enteritidis, Infantis, Montevideo, Thompson y Typhimurium. En particular, se detectó Salmonella Infantis en 12 muestras; en 11 de estos, fue el serovar minoritario (el segundo más abundante después del serovar dominante). Los autores señalan que los resultados sugieren que las intervenciones antimicrobianas dirigidas a la reducción de las serovariedades de Salmonella fueron efectivas en la serovariedad dominante identificada. Sin embargo, la falta de una imagen completa de los serovares de Salmonella presentes en las parvadas de reproductores crea una oportunidad para que los serovares minoritarios eludan las estrategias de mitigación antimicrobiana.

La aplicación exitosa del método CRISPR-SeroSeq también se demostró en un estudio a gran escala realizado en Ontario, Canadá, para encuestar serovares de Salmonella en granjas avícolas de toda la provincia.3 El método CRISPR-SeroSeq se utilizó para analizar 442 Salmonella positivos (por PCR) muestras ambientales recolectadas de 192 granjas avícolas y revelaron una imagen completa de los serovares de Salmonella en las granjas. Las muestras se tomaron durante un período de diez meses de ventiladores (n = 178), cintas de huevos (n = 96), cintas de estiércol (n = 87), pisos (n = 37) y otros sitios (n = 44). Se detectaron un total de 25 serovariedades en 430 de las muestras, y el 73,1 % de las muestras contenía múltiples (hasta siete) serovariedades en una sola muestra. Los serovares más comunes identificados en las granjas fueron Salmonella Kiambu (55,7 por ciento), Infantis (48,4 por ciento), Kentucky (27,1 por ciento), Livingstone (26,6 por ciento) y Mbandaka/Montevideo (23,4 por ciento). Se distribuyeron diferentes serovariedades en diez zonas geográficas productoras de la provincia (Figura 1).

Salmonella Kiambu e Infantis fueron las más comunes en las diferentes zonas geográficas. Salmonella Rissen se detectó con mayor frecuencia en las zonas del norte en comparación con las zonas del sur. Dentro de una granja, se encontró que diferentes superficies de muestreo contenían diferentes serovares, aunque se detectaron 1 o 2 serovares comunes de todos los tipos de superficies muestreadas en base al examen de un número limitado de granjas. Las muestras del ventilador de ventilación dieron como resultado un número promedio más alto (2,7) de serovares detectados por muestra en comparación con el promedio general (2,4). Se detectaron más serovares en los meses cálidos (junio-octubre), con un promedio de 2,6 serovares detectados por muestra en comparación con los meses fríos (noviembre-marzo), con un promedio de 2,1 serovares detectados. En general, el método CRISPR-SeroSeq detectó serovares de Salmonella, en promedio, 3,3 veces más frecuentes que los detectados por cultivo tradicional. En 616 casos entre 384 muestras que se serotipificaron tradicionalmente, se pasó por alto un serovar detectado por CRISPR-SeroSeq en la misma muestra por cultivo. Esto incluyó a Salmonella Enteritidis, el principal serovariedad de preocupación para las granjas de huevos, que fue detectado por CRISPR-SeroSeq y pasado por alto por cultivo en una de las tres ocasiones en que se detectó entre 5392 muestras ambientales analizadas durante un período de diez meses.

Los serovares de Salmonella más comunes (Kiambu, Infantis, Kentucky, Livingstone y Mbandaka/Montevideo) detectados por CRISPR-SeroSeq en el estudio de Ontario reflejan un cambio significativo en los serovares predominantes, como se informó anteriormente. Un estudio de ponedoras y granjas de pollitas entre 2002 y 2003 en Ontario identificó las serovariedades Salmonella Heidelberg, Typhimurium, Thompson, Schwarzengrund y Agona como las más comunes.22 Un estudio posterior de las operaciones de cría de ponedoras y pollitas en Ontario entre 2009 y identificó a Salmonella Heidelberg (50,7 por ciento) como el serovariedad más frecuente, seguido de Thompson, Schwarzengrund, Agona y Kentucky.23 Un estudio temporal más reciente de muestras de pelusa de criaderos de aves de Ontario de 2009 a 2018 reveló Salmonella Kentucky, Enteritidis, Heidelberg y Senftenberg como los serovares más frecuentemente aislados.24

Uno de los cambios más significativos es Salmonella Heidelberg, que mostró una alta prevalencia en estudios anteriores, pero se detectó en solo el 5 % de las granjas en el estudio reciente de los autores.3 También se observó una disminución en la prevalencia de Salmonella Heidelberg en aves de corral de 2016 a 2020 en un estudio realizado en los EE. UU.21 Otro cambio significativo es Salmonella Kiambu, que surgió como el serotipo detectado con mayor frecuencia por CRISPR-SeroSeq y el tercer serotipo detectado con mayor frecuencia por cultivo en granjas avícolas de Ontario,3 aunque anteriormente no se notificaba lo suficiente. Este hecho es motivo de especial preocupación, ya que Salmonella Kiambu estuvo implicada en el 23,5 % (50/213) de los brotes de Salmonella de 2017 en los EE. UU.25 Salmonella Rissen fue otro serovar emergente en el estudio de los autores, con una tasa de detección de más del 21 % en las granjas por CRISPR-SeroSeq, pero se detectó en solo el 1 por ciento de las granjas por cultivo.3 La subestimación significativa de Salmonella Rissen previamente o por cultivo es motivo de preocupación, ya que Salmonella Rissen también se ha reconocido como un serovariedad emergente y subnotificado entre humanos en diferentes países.26

Con la disponibilidad de numerosos métodos de PCR y el método CRISPR-SeroSeq validado, ahora es factible detectar serovares de Salmonella sin aislamiento de cultivo para mejorar los programas actuales de monitoreo de Salmonella en granjas avícolas o instalaciones de producción. En la Figura 2 se muestra un enfoque de prueba general. Las muestras ambientales de aves de corral se preenriquecen primero en agua de peptona tamponada (BPW) durante 18 a 24 horas. Los preenriquecimientos luego se someten a PCR en tiempo real para detectar la presencia de Salmonella. Las muestras PCR positivas se analizan a través de CRISPR-SeroSeq para identificar los serovares de Salmonella contenidos en las muestras. CRISPR-SeroSeq puede proporcionar resultados de serovariedad en un plazo de 36 a 48 horas a partir de extractos de ADN de las muestras PCR positivas. Cuando se necesita la confirmación del cultivo (p. ej., tras la detección de un serovariedad crítico, como Salmonella Enteritidis, o para investigaciones de brotes), los preenriquecimientos positivos para PCR pueden someterse a separación inmunomagnética (IMS) para concentrar las células diana, utilizando perlas magnéticas. unido covalentemente con anticuerpos específicos para especies de Salmonella, o para un subgrupo seleccionado (como el Grupo D) de Salmonella enterica. A continuación, los concentrados de células de Salmonella se enriquecen en un medio selectivo secundario, como RVS, TBG u otros medios selectivos, durante 18 a 24 horas. Los enriquecimientos secundarios también pueden someterse a CRISPR-SeroSeq para identificar las serovariedades de Salmonella, o someterse al aislamiento del cultivo sembrando en agares selectivos. Las colonias sospechosas de Salmonella se confirman mediante reacciones bioquímicas o mediante PCR. Las colonias confirmadas se serotipifican de forma tradicional o por WGS. En este caso, se debe analizar una gran cantidad de colonias objetivo de cada placa presuntamente positiva para Salmonella para aumentar la tasa de detección si todos los serovares de Salmonella o los serovares menos abundantes deben confirmarse mediante cultivo.

Los brotes de Salmonella, las enfermedades avícolas y los eventos de contaminación de productos avícolas asociados con varios serovares de Salmonella enfatizan la necesidad de monitorear todos los serovares en la cadena de producción avícola. Este monitoreo ayudará a obtener información sobre la dinámica de las serovariedades y las serovariedades emergentes, y garantizará la detección de serovariedades de preocupación crítica para ayudar a mejorar las prácticas de mitigación. Las muestras ambientales de las granjas avícolas a menudo revelan fácilmente la presencia de Salmonella en las parvadas, la fuente principal.

Los métodos rápidos de detección mediante PCR están fácilmente disponibles para fines de detección. La detección rutinaria de todos los serovares de Salmonella a través de herramientas metagenómicas avanzadas es técnicamente factible en la actualidad en un número limitado de laboratorios de pruebas de seguridad alimentaria. Se espera que una mayor implementación de las tecnologías y herramientas disponibles en los programas de monitoreo, después de que se definan los cambios propuestos en el marco regulatorio, las pautas específicas y los protocolos, ayude a reducir las infecciones por Salmonella vinculadas a los productos avícolas.

Shu Chen, Ph.D., es científico investigador sénior y director de la Unidad de Biología Analítica del Laboratorio de Agricultura y Alimentos del Departamento de Ciencias de los Alimentos de la Universidad de Guelph.

Carlos Leon-Velarde, Ph.D., es supervisor de la Unidad de Microbiología de Alimentos en el Laboratorio de Agricultura y Alimentos del Departamento de Ciencias de los Alimentos de la Universidad de Guelph.

Nicola Linton, Ph.D., es científica de desarrollo de ensayos moleculares en la Unidad de Biología Molecular del Laboratorio de Agricultura y Alimentos del Departamento de Ciencias de los Alimentos de la Universidad de Guelph.